抗原制备及纯化
抗原制备: 参照文献[10]制备 MRJ 抗原。复苏pET28a-mrj 转 Rosetta 菌0种 接 种 于 具 Kana抗 性 的10 mL液体培养基中的,37 ℃ 培养过夜,次日以 1∶ 50转瓶进行扩大培养,当菌液 OD600达 0. 6时加入浓度为 5 mmol /L 的 IPTG,弗氏佐剂的作用,37 ℃ 诱导 8 h超声碎裂后进行考马斯亮蓝染色检验,有目的蛋白的大量表达。抗原大量制备及纯化: 以 5 × 10 -4 mol /L浓度的IPTG,37 ℃ 条件下大量诱导( 200 mL 菌液) 8 h 后收集样品,超声裂解后将所得 MRJ 蛋白过 Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,考马斯亮蓝染色后检测目的蛋白纯度高于 90% ,可用于单克0隆抗0体制备动物免0疫的抗原。
使用方法
1. 用生理盐水将抗原稀释到2倍zui终浓度(按小鼠每针次50μl、家兔每针次100μl用量配制)。备注:推荐使用的抗原用量为小鼠每针次10-20μg、家兔每针次20-50μg。
2. 用振荡器充分混匀佐剂,无菌条件下取出所需用量(按小鼠每针次50μl、家兔每针次100μl)与抗原按体积比1:1混合,并用振荡器剧烈振荡5-10min,直至静止放置10min水油相不分层。备注:与抗原混合前佐剂分层属正常现象,但必须充分混匀后才能取用。
3. 通过皮下或肌肉单点注射免0疫动物,小鼠每针次100μl,家兔每针次200μl。
(1)佐剂与抗原混合后应尽快注射,若放置时间较长出现水油相分层,则必须按上述步骤2重新振荡混匀;
(2)抽入针管前应摇匀,抽入针管后应尽快注射;
(3)尽量选择引流淋巴0结附近(如腋窝和腹0股0沟附近)的皮下或肌肉进行免0疫。
甲胎蛋白(AFP)是一种胎儿特异性糖蛋白,分子量约70,000~72,000道尔顿^,在胚胎肝0脏和卵黄囊中合成,正常人血中含量甚微。1972年有人首0次报道开放性神0经管畸形胎儿、羊水中有高水平的AFP。若胎儿羊水中AFI’值高于均值常见于患无脑儿或脊柱裂的胎儿,亦见于其他多种畸形,如先0天性shen病、食道或肠闭锁、囊0性水瘤、骶尾部畸胎瘤、Rh血型不和、先天愚型、先0天性性腺发育不全等。1983年发现母体血0清AFP水平的降低与唐氏综合征有密切关系一。因此制备高0效特异的AFP单克0隆抗0体(McAb)具有重要的意义。
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