黑龙江干细胞外泌体提取暨南大学

外泌体富含胆固醇和鞘磷脂。2007年，Valadi等发现鼠的肥大细胞分泌 的exosome可以被人的肥大细胞捕获，并且其携带的mRNA成分可以进入细胞浆中可以被翻译成蛋白质，不仅仅是mRNA，exosomes所转移的microRNA同样具有生物活性，在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平。这一发现使得研究人员对exosome的研究热情激增，截止已经通过286项研究发现了41860种蛋白质、2838种microRNA、3408种mRNA。

一类外泌体中常见的细胞质蛋白是Rabs蛋白，是鸟苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一种。它可以调节外泌体膜与受体细胞的融合，有文献报道称RAB4,RAB5和 RAB11主要出现于早期以及回收的核内体中，RAB7 和RAB9主要出现于晚期的核内体。现有大量的研究发现外泌体中含有40种RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌体中富含具有外泌体膜交换以及融合作用的膜联蛋白（包括膜联蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63,CD81 和CD9)）、

热休克蛋白家族（(HSP60, HSP70, HSPA5, CCT2和HSP90以及一些细胞特的蛋白包括A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。其它一些外泌体中的蛋白包括多种的代谢类的酶（GAPDH,烯醇化酶 1, 醛缩酶 1, PKM2, PGK1, PDIA3, GSTP1,DPP4, AHCY, TPL1, 抗氧化蛋白,P4HB, LDH, 亲环素 A,FASN, MDH1 和CNP）、核糖体蛋白（RPS3）、信号转导因子（黑色素瘤分化相关因子,ARF1, CD2, 人类红细胞膜整合蛋白,SLC9A3R1）、粘附因子（MFGE8、整合素）、细胞骨架蛋白以及泛素等。

外泌体的提取主要包括以下几种方式。

一是超速离心法，这是外泌体提取Zui常用的方法。此种方法得到的外泌体量多，纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块， 由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体 。

二是过滤离心， 这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。

三是密度梯度离心法， 用此种方法分离到 的外泌体纯度高，前期准备工作繁杂，耗时，量少。

四是免疫磁珠法，这种方法可以保证外泌体形态的完整，特高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，非中性pH 和非 生理性盐浓度会影响外泌体生物活性， 不便进行下一步的实验。

五是PS亲和法，该方法将PS（磷脂酰丝氨酸）与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射。2016.9《Scientific Reports》 杂志发表了该方法数据，表明PS法可提取相当高纯度的外泌体。 

六是色谱法，这种方法分离到的外泌体在 电镜下大小均 一，需要特殊的设备 ， 应用不广泛 。